مطياف الوميض
Fluorescence spectrometer  

مقدمة:
هذا المطياف يحلل الاستضواء الناتج عن العينة عند امتصاصها قدر من الطاقة ،  ثم تعيد بثه مرة أخرى ، و يطلق على مطياف الوميض أسماء عديدة منها :-   Spectrofluorimeter  أو   Fluorescence spectrometer (شكل 9-1).

وفي هذا المطياف يتم استخدام حزمة من الضوء - عادة ما تكون في نطاق الأشعة فوق البنفسجية – تمر هذه الحزمة على العينة ، فيحدث امتصاص absorption لهذا الطيف مما يترتب عليه حدوث اثارة  للألكترونات  excitationفي جزيئات المركب نتيجة الطاقة الممتصة ثم تعود هذه الاليكترونات الى الحالة المستقرة مرة أخرى ground state  وذلك عن طريق اعادة بث أو انبعاث الطاقة الممتصة مرة أخرى emission في صورة وميض  fluorescence  ولكن الطاقة المنبعثة تكون أقل من الطاقة الممتصة وكذلك يكون طول موجة الطيف المنبعث أكبر  من طول موجة الطيف الممتص ،  فبينما يكون الطيف الممتص في نطاق الأشعة فوق البنفسجية نجد أن الطيف المنبعث قد يصل الى نطاق الطيف المرئي والذي يتم كشفه بواسطة كشاف الوميض 

نظرية عمل مطياف الوميض:
يوجد عدد قليل نسبيا من المركبات التي لها خاصية الوميض أو الاستضواء ، مثل :- مركبات الأفلاتوكسينات aflatoxins ،  والريبوفلافينriboflavin   ، والمركبات الهيدروكربونية الأروماتية العديدة الأنويةpolynuclear aromatic hydrocarbons  .   وهذه المركبات يمكن كشفها بواسطة مطياف الوميض.

أما المركبات التي لا تمتلك خاصية الوميض ، مثل :- الأمينات الأليفاتية aliphatic amines ، أو الأحماض acids  يمكن تحويلها الى مشتقات فلوريسينية fluorescent derivatives باضافة مجموعة فلوروفور اليها fluorophore group

وقد ساهم استخدام هذا المطياف بنجاح في الكشف عن العديد من المركبات العضوية الأروماتية العديدة الأنوية في المياه المتخلفة عن المصانع  waste water  ، في تقدير المواد الفعالة في الأدوية والعقاقير ، وفي رصد وتتبع السموم الفطرية  mycotoxins  في الفول السوداني ومنتجاته وكذلك منتجات الحبوب المخزونة والتوابل والأعلاف الحيوانية وغيرها .

وعموما يستخدم مطياف الوميض في مجال الأبحاث الكيميائية ، والبيوكيميائية ، والطبية لتحليل المركبات العضوية ، كما يستخدم في تمييز الأورام الجلدية الحميدة والخبيثة.

ولكي نفهم ميكانيكية حدوث ظاهرة الوميض في مثل هذه المركبات يجب علينا النظر بعناية الى شكل (9- 3)  حيث نجد أنه عند انتقال أليكترونات الذرة من حالة الثبات      (E0) electronic ground state  الى حالة الاثارة  electronic excited state (E1)   فانها تمر بمستويات اهتزازية  (v0, v1, v2, v3 ) E0   في الحالة الأليكترونية المستقرة  ثم تمر بمستويات اهتزازية أخرى  (v0, v1, v2, v3) E1  في الحالة الأليكترونية المثارة.  

أي أن حدوث انتقال أليكتروني الى مستوى طاقي عالي نتيجة الاثارة يصاحبه في نفس الوقت انتقال اهتزازي عالي الطاقة وكذلك يصاحبه انتقالات دورانية.

وفي مطياف الوميض تمتص المادة المراد دراستها فوتونات ضوئية فيحدث لها اثارة من الحالة الأليكترونية المستقرة الى واحدة من الحالات الاهتزازية المختلفة في الحالة الأليكترونية المثارة.

وحدوث تصادم بين الجزيئات المثارة والجزيئات الأخرى يسبب فقد الطاقة الاهتزازية حتى تصل الجزيئات المثارة أليكترونيا الى أدنى مستوى اهتزازي لها في الحالة الأليكترونية المثارة  (v0, v1, v2) E1    ، ثم تهبط مرة أخرى الى مستويات اهتزازية منخفضة في الحالة الأليكترونية المستقرة   (v0, v1, v2) E0   مؤدية الى انبعاث فوتونات.  

وبما أن الجزيئات يمكنها أن تهبط الى أي مستوى من المستويات الاهتزازية العديدة في الحالة الأليكترونية المستقرة فان الفوتونات المنبعثة يكون لها طاقات وترددات مختلفة عن بعضها البعض.

ولذلك فانه بتحليل الترددات المختلفة للضوء المنبعث مع الكثافة النسبية لكل تردد بواسطة طيف الاستضواء يمكن تقدير تركيب المستويات الاهتزازية المختلفة في الجزيء.

وبالتجربة يمكن قياس الترددات المختلفة للضوء المنبعث من العينة في صورة استضواء  fluorescent light   وذلك بتثبيت طول موجة الشعاع المسبب لعملية الاثارة  excitation light  ويطلق على هذه العملية تسجيل طيف الانبعاث  emission spectrum  ،   أما قياس طيف الاثارة excitation spectrum  فانه يتم عن طريق تسجيل عدد من أطياف الانبعاث عند أطوال موجية مختلفة من طيف الاثارة.  


مكونات مطياف الوميض:  يتكون مطياف الوميض (شكل 9-4) من الوحدات التالية:
• مصدر للطاقة  Energy Source
• موحد موجات الاثارة  Excitation monochromator
• خلية العينة  Sample cell
• موحد موجات الانبعاث  Emission monochromator
• الكشاف  Detector
• المسجل  Recorder

مصدر الضوء:
يمكن استخدام مصادر عديدة لضوء الاثارة و منها:
1. أشعة الليزر    Lasers :  
شعاع الليزر يبعث ضوءا  عالي التألق أو السطوع أو الاشعاع  high irradiance  بطول موجي ضيق جدا  very narrow wavelength interval  في حدود تقريبا 0.01 nm  وبالتالي يكون المرشح وموحد الموجات غير ذات أهمية عند استخدام شعاع الليزر كمصدر للضوء  ،  ولكن من عيوب استخدام الليزر أنه لايمكن تغيير طول الموجة بكثير.

2. لمبة الزئبق  Mercury lamp  أو  لمبة الزينون  Xenon arcs lamp :  
لمبة الزئبق تبعث طيف خطي  line  أي أنها تبعث طيف يكون فيه أطوال الموجات متقاربة جدا  بعكس لمبة الزينون التي تعطي طيف مستمر بشدة أو كثافة ثابتة في المدى    300-800 nm  وبتألق أو اشعاع كافي لعمل قياسات حتى  200 nm
موحدات الموجات:
يوجد نوعان من مطيافيات الوميض ، الأول:- يسمى filter fluorometers  ، والنوع الثاني يسمى:-   spectrofluorometers  

ويمكن استخدام المرشحات كما في أجهزة  Filter Fluorometers  لفصل الضوء الساقط  incident light  عن ضوء الاستضواء   fluorescent light

كما يمكن استخدام المحزوز في diffraction grating. وكذلك في أجهزة spectrofluorimeters  لفصل الضوء الساقط  عن ضوء الاستضواء.  
وموحدات الموجات يمكنها نفاذ ضوء بطول موجة قابل للتعديل ،  والنوع الأكثر شيوعا منها هو   diffraction grating  حيث يدخل الضوء المجمع  collimated light  على المحزوز ويخرج بزوايا مختلفة على حسب أطوالها الموجية ، وبذلك نجد أن موحد الموجات يختار الأطوال الموجية التي يسمح لها بالنفاذ.
ولكي نسمح بقياس  anisotropy measurements ، فمن الضروري اضافة مرشحي استقطاب أحدهما بعد الـ excitation monochromator ، والثاني قبل الـ emission monochromator
لا يوجد موحد موجات مثالي حيث أن جميعها تسمح بنفاذ بعض الضوء الشارد أو الضال stray light ، بينما موحد الموجات المثالي هو الذي يسمح فقط بنفاذ الضوء في المدى المحدد.

الكشاف:
يوضع الكشاف على طولين موجيين ،  الأول طول موجة خاص باثارة مجموعة الفلوروفور excitation wavelength ، والثاني طول الموجة الخاص بانبعاث الضوء من هذه المجموعة أيضا emission wavelength ، ويتم اختيار طول الموجتين السابقتين باستخدام مرشحات تمرر حزمة ضيقة جدا من الضوء  narrow band     كما يمكن استخدام   dual filter fluoromiter   (شكل 9-5).

 
       Simple filter fluorimeter                          Dual filter fluorimeter



والكاشف يمكن أن يكون أحادي المحول  single-channeled ، أو يكون متعدد المحول   multi-channeled . والكشاف الأحادي المحول يمكنه أن يكشف كثافة طول موجة واحدة كل مرة بينما الكشاف المتعدد المحول يمكنه تلقائيا قياس كثافة العديد من أطوال الموجات في المرة الواحدة مما يجعل وجود موحد الموجات ليس ضروريا.  والعديد من الكشافات تعمل بهذين النظامين.

وأجهزة كشف الوميض الأكثر تنوعاً والتي تحتوي على موحد موجات ثنائي  dual monochromators وكذلك مصدر ضوء إثارة مستمرِ  continuous excitation light source  يمكنها أَن  تسجل كلا من طيف الإثارة ، وطيف الوميض.

وعند قياس طيف الوميض فيجب مراعاة تثبيت طول موجة طيف الاثارة ، ويفضل أن يكون عند طول الموجة التي يحدث عندها أعلى امتصاص ثم يتم عمل مسح لموحد موجات الوميض emission monochromator .

واذا أردنا قياس طيف الاثارة ، فانه يجب تثبيت طول موجة طيف الانبعاث المار خلال مرشح أو موحد موجات الانبعاث emission filter or monochromator  ثم يتم عمل مسح لموحد موجات الاثارة excitation monochromator

عموما طيف الإثارة يكون مماثل لطيف الامتصاصِ ، على أساس أن شدة الوميض يتناسب طرديا مع الإمتصاصِ.

تحليل البيانات:
عند التركيزات المنخفضة يتناسب شدة الوميض طرديا مع تركيز الفلوروفور  Fluorophore وقد تحدث أخطاء في القياس بسبب العينة نفسها ،  ولذلك فان بعض سمات العينة يجب أن تؤخذ في الحسبان.
• التحطم الضوئي للعينة  photodecomposition  قد يخفض من شدة الاستضواء مع مرور الوقت.
• تشتت الضوء scattering of light  يسبب استرخاء للجزيء ويغير من المستوى الاهتزازي.
• في طيف الاستضواء نرى دائما اختلاف نسبي للعدد الموجي لطيف الاثارة عند عدد موجي ثابت ، على سبيل المثال نجد منحنى peak عند عدد موجي      3600 cm−1  أقل من طيف الاثارة في جزيء الماء.
وعموما يمر الضوء الصادر عن مصدر الاثارة  excitation source  خلال المرشح أو موحد الموجات ويصطدم بالعينة ، فتمتص العينة جزء من هذا الضوء الساقط  incident light   ويحدث استضواء  fluorescence   لبعض الجزيئات في العينة.  
وينبعث ضوء الاستضواء fluorescent light   في جميع الاتجاهات ،   يمر جزء من ضوء الاستضواء خلال المرشح الثاني أو موحد الموجات الثاني ويصل الى الكشاف والذي يكون موضوعا عموديا أي بزاوية  90°  بالنسبة لحزمة الضوء الساقط عليه وذلك لتفادي وصول الضوء النافذ أو المنعكس عن الضوء الساقط الى الكشاف.