م\ تحضير الوسط الغذائي preparation of nutrient medium
يعتبر الوسط الغذائي(Media) بمثابة البيئة (بيئة النبات التي يزرع فيها) وهو من العوامل المهمة التي تؤثر في الجزء النباتي (Explant) ، وهناك أنواع من الاوساط الغذائية ومن اشهرها (MS) (Murashige &Skoog 1962) ، White 1963، Olive medium الخاص بنبات الزيتون ، Woody Plant Medium(WPM) الخاص بالنباتات المتخشبة ،KH Medium و B5 Medium وغيرها من الاوساط.
المكونات الرئيسية للوسط الغذائي :
تتكون جميع الاوساط الغذائية التى تستخدم فى زراعة ألانسجة النباتية المختلفة بصفة عامة من مكونات أساسية وهى:
- مواد غير عضوية (Non organic substances)(العناصر كبرى والصغرىMacro and micro elements )
فالعناصر الكبرى تحتاجها كل النباتات لذلك لابد من إضافتها فى بيئة زراعة الأنسجة النباتية وعددها سبع عناصر وهى(النيتروجين (N) ، الفسفور (P) ، البوتاسيوم (K) ، الكبريت (S ) ، الكالسيوم (Ca ) ، الماغنسيوم (Mg) ، الحديد (Fe)) ، اما العناصر الصغرى فهي عناصر ضرورية يحتاجها النبات ولكن بكميات ضئيلة جدا قد تكون سامة للنبات إذا أضيفت بكميات زائدة عن المطلوب وتشمل (البورون Boron(B) ، موليبدم Molybdenum(Mo) ، المنغنيز Manganese(Mn) ، الكوبالت Co ، زنك Zn ، - نحاس Cu ، كلور Cl ، - يود Iodine ).
وان سبب اختيار هذه المجموعة من العناصر سواء اكانت صغرى ام كبرى لان لها دور مهم في مراحل نمو النسيج المزروع مثلا النتروجين يؤثر على معدل نمو النبات وضرورى لتكوين الكلوروفيل والقلويدات والأحماض النووية nuclic acids التي تحمل الشفرات الوراثية وهرمونات النمو والأحماض الأمينية amino acids ، والفوسفور يتركز فى الأجزاء المرستيمية إلا أن دوره غير معروف بالضبط ويرجح أن له دور فى تنشيط الإنزيمات ، البوتاسيوم (K ) ضرورى للإنقسام الطبيعى للخلية وتكوين الكربوهيدرات والبروتينات وهكذا لبقية العناصر الاخرى حيث لكل عنصر دور ووظيفة يقوم بها .
- المواد عضوية Organic substances التي تشمل الفيتامينات Vitamins ،الكاربوهيدرات Carbohydrate والحوامض الامينية Amino acids .
فكل وسط غذائي يحتاج الى السكريات كمصدر للطاقة واكثر هذه السكريات استعمالا هو السكروز( Sucrose)، اما بقية انواع السكريات فتعد مصدرا ضعيفا للكاربون مثل المالتوز(Maltose) ، كالاكتوز(Galactose)، المانوز(Manose) واللاكتوز(Lactose)، وكذلك للفيتامينات دورا مها حيث انها تعتبر عاملافي النظم الانزيمية وهي مطلوبة بكميات قليلة جدا ، اما الحوامض الامينية والمعقدات العضوية الاخرى فتعد مهمة جدا للجزء النباتي المزروع والتي تضاف بهيئة Casain hydrolysis اوبهيئة L-glutamine وقد تضاف سلفات الادنين (Adenine sulfate) الى الوسط لكي تحسن من نموه وتكوين الافرع .
- منظمات نموGrowth regulatoes (أوكسينات Auxins وسيتو كينيناتCytokinins):
الاوكسينات والسايتوكاينينات تستخدم بكثرة في مجال الزراعة النسيجية ، اما الجبريلينات ومنظمات النمو الاخرى تستخدم بكميات محدودة ، فالاوكسينات مركبات عضوية تعمل على تحفيز استطالة النمو للمجموع الخضري للنبات ويعتبر اندول حامض الخليك (IAA) الاوكسين الطبيعي في النبات .
س\ ماهي اهم انواع الاوكسينات ؟
وتضاف الاوكسينات بحدود (0.1-10) ملغم\لتر والدور الرئيسي للاوكسينات هو تاثيرها على انقسام الخلايا وكذلك استطالة السلاميات والسيقان وتكوين الجذور .
اما السايتوكاينيات ايضا لها دور مهم في انقسام الخلايا بالاضافة الى الكثير من العمليات الفيسيولوجية الاخرى مثل شيخوخة الورقةleaf senility وانتقال المغذيات nutrients transition والسيادة القمية Apical dominance وتستخدم بتراكيز تتراوح بين (0.01-10) ملغم\لتر، ومن السايتوكاينيات الطبيعية هو الزياتين(Zeatin) .
س\ ماهي اهم انواع السايتوكاينينات ؟
وهناك مكونات اخرى للوسط الغذائي :
• الاكار Agar : مادة هيدروكربونية وهو عبارة عن مسحوق يحصل عليه من الطحالب البحرية ويضاف بمقدار 2-7 غم \لتر واهم انواع الاكار هو ال Defco agar ويستخدم في الزراع النسيجية لاسباب ، ماهي ؟
• وهناك مركبات اخرى مثل حليب جوز الهند (Coconut milk) الذي يساعد على النمو والتمييز للاجزاء النباتية عند زراعتها في الاوساط الغذائية ، يستخدم ايضا الفحم الفعال Activs charcool) حيث انه يعتبر عامل منشط ومثبط وله دور في تحفيز النمو والتمييز العضوي (Organogenesis) والتمييز الجنيني (Embryogenesis) في العديد من النباتات مثل النخيل (Date palm).
س\ ماهي وظائف الفحم الفعال ؟
اما تحضير الوسط الغذائي فيتم كالاتي :
يعد الوسط الغذائي( MS) Murashige &Skoog 1962 من اكثر الاوساط الغذائية استخداما في مجال الزراعة النسيجية ولمعظم النباتات لذا سوف ندرس تحضير هذا الوسط ، ويتكون من اربع محاليل اصل Stock solutions بالاضافة الى عدد من المركبات الاخرى والجدول التالي يبين مكونات كل محلول من هذه المحاليل الاصل :
تذوب كميات الاملاح والفيتامينات الذكورة اعلاه كل على حدة وبصورة تدريجية ثم تنقل الى دورق معياري حجمه 1000 مل ويكمل الحجم الى العلامة بالماء المقطر مرتين ويتم التحضير كالاتي :
1- نضع 400 مل من الماء المقطر مرتين في دورق حجمه 1000 مل .
2- نضيف 100مل من المحلول الاصل رقم 1.
3- نضيف 1مل من المحلول الاصل رقم 2.
4- نضيف 10مل من المحلول الاصل رقم 3.
5- نضيف 1مل من المحلول الاصل رقم .
6- السكروز بمقدار30 غم \لتر
7- تضاف منظمات النمو من الاوكسينات والسايتوكاينينات حسب طبيعة التجربة.
8- بعدها تخلط جيدا لحين الاذابة ثم يكمل الحجم الى 800مل من الماء المقطر مرتين.
9- تعديل درجة حموضة الوسط Ph للوسط 5.7 ±0.1 باستعمال محلول 1 عياري من حامض Hcl او محلول 1 عياري من القاعدة NaoH .
10- نضيف مادة الاكار بمقدار 7غم\لتر ثم يكمل الحجم النهائي الى اللترباستعمال الماء المقطر مرتين، ثم يوضع الوسط على جهاز الخلط المغناطيسي لاذابة الاكار ةتجانس الوسط الغذائي .
11-يصب الوسط الغذائي مباشرة في انابيب الزراعة سعة (24 ×150)ملم بواقع 10مل لكل انبوب وتغلق الفوهة بسدادة قطنية من الداخل وتغلق من الخارج بورق الالومنيوم فويل.
12-نقل اوعية الزراعة الى جهاز التعقيم Autoclave بالبخار وعلى درجة حرارة 121مْ وضغط 1.04كغم\سم2 ولمدة 15دقيقة .
13-تستخرج الانابيب من المعقام وتترك لتبرد في درجة حرارة الغرفة لحين الاستعمال.
عند تحضير الوسط الغذائي يجب ملاحظة بعض الامور المهمة :
•• الماء : Water
يعتبر من اهم مكونات الوسط الغذائي حيث يشكل حوالي 95% وينصح ان يكون الماء مقطرا وان يكون من النوع الثنائي التقطير Double distilled water .
•• درجة الحموضة Ph :
ان درجة حموضة الوسط مهمة جدا لجعل الوسط مناسبا لنمو الجزء او عدم نموه درجة الحموضة 5.7±0.1 مناسبة لنمو النبات داخل الوسط الا ان درجات الحموضة الاقل من 4.5 والاعلى من 7 تؤدي الى ايقاف النمو.
س\ لماذا انخفاض درجة حموضة الوسط نؤدي الى ايقاف النمو؟
تعقيم الوسط الغذائي Sterilization of nutrient medium
كما بينا سابقا بأن اهم المشاكل التي تواجه تقنية الزراعة النسيجية هو التلوث (Contamination) ، وهناك مصادر عديدة للتلوث منها العاملون في المختبر او المواد المستخدمة او التهوية الغير جيدة وكذلك الوسط الغذائي ، حيث انه يجب ان يعقم الوسط الغذائي بصورة جيدة لضمان التخلص من التلوث ويتم تعقيم الوسط باستخدام الاوتوكليف (Autoclave) على درجة حرارة 121 مْ وضغط 1.04كغم\سم2 ولمدة 15دقيقة .
يعتبر الوسط الغذائي(Media) بمثابة البيئة (بيئة النبات التي يزرع فيها) وهو من العوامل المهمة التي تؤثر في الجزء النباتي (Explant) ، وهناك أنواع من الاوساط الغذائية ومن اشهرها (MS) (Murashige &Skoog 1962) ، White 1963، Olive medium الخاص بنبات الزيتون ، Woody Plant Medium(WPM) الخاص بالنباتات المتخشبة ،KH Medium و B5 Medium وغيرها من الاوساط.
المكونات الرئيسية للوسط الغذائي :
تتكون جميع الاوساط الغذائية التى تستخدم فى زراعة ألانسجة النباتية المختلفة بصفة عامة من مكونات أساسية وهى:
- مواد غير عضوية (Non organic substances)(العناصر كبرى والصغرىMacro and micro elements )
فالعناصر الكبرى تحتاجها كل النباتات لذلك لابد من إضافتها فى بيئة زراعة الأنسجة النباتية وعددها سبع عناصر وهى(النيتروجين (N) ، الفسفور (P) ، البوتاسيوم (K) ، الكبريت (S ) ، الكالسيوم (Ca ) ، الماغنسيوم (Mg) ، الحديد (Fe)) ، اما العناصر الصغرى فهي عناصر ضرورية يحتاجها النبات ولكن بكميات ضئيلة جدا قد تكون سامة للنبات إذا أضيفت بكميات زائدة عن المطلوب وتشمل (البورون Boron(B) ، موليبدم Molybdenum(Mo) ، المنغنيز Manganese(Mn) ، الكوبالت Co ، زنك Zn ، - نحاس Cu ، كلور Cl ، - يود Iodine ).
وان سبب اختيار هذه المجموعة من العناصر سواء اكانت صغرى ام كبرى لان لها دور مهم في مراحل نمو النسيج المزروع مثلا النتروجين يؤثر على معدل نمو النبات وضرورى لتكوين الكلوروفيل والقلويدات والأحماض النووية nuclic acids التي تحمل الشفرات الوراثية وهرمونات النمو والأحماض الأمينية amino acids ، والفوسفور يتركز فى الأجزاء المرستيمية إلا أن دوره غير معروف بالضبط ويرجح أن له دور فى تنشيط الإنزيمات ، البوتاسيوم (K ) ضرورى للإنقسام الطبيعى للخلية وتكوين الكربوهيدرات والبروتينات وهكذا لبقية العناصر الاخرى حيث لكل عنصر دور ووظيفة يقوم بها .
- المواد عضوية Organic substances التي تشمل الفيتامينات Vitamins ،الكاربوهيدرات Carbohydrate والحوامض الامينية Amino acids .
فكل وسط غذائي يحتاج الى السكريات كمصدر للطاقة واكثر هذه السكريات استعمالا هو السكروز( Sucrose)، اما بقية انواع السكريات فتعد مصدرا ضعيفا للكاربون مثل المالتوز(Maltose) ، كالاكتوز(Galactose)، المانوز(Manose) واللاكتوز(Lactose)، وكذلك للفيتامينات دورا مها حيث انها تعتبر عاملافي النظم الانزيمية وهي مطلوبة بكميات قليلة جدا ، اما الحوامض الامينية والمعقدات العضوية الاخرى فتعد مهمة جدا للجزء النباتي المزروع والتي تضاف بهيئة Casain hydrolysis اوبهيئة L-glutamine وقد تضاف سلفات الادنين (Adenine sulfate) الى الوسط لكي تحسن من نموه وتكوين الافرع .
- منظمات نموGrowth regulatoes (أوكسينات Auxins وسيتو كينيناتCytokinins):
الاوكسينات والسايتوكاينينات تستخدم بكثرة في مجال الزراعة النسيجية ، اما الجبريلينات ومنظمات النمو الاخرى تستخدم بكميات محدودة ، فالاوكسينات مركبات عضوية تعمل على تحفيز استطالة النمو للمجموع الخضري للنبات ويعتبر اندول حامض الخليك (IAA) الاوكسين الطبيعي في النبات .
س\ ماهي اهم انواع الاوكسينات ؟
وتضاف الاوكسينات بحدود (0.1-10) ملغم\لتر والدور الرئيسي للاوكسينات هو تاثيرها على انقسام الخلايا وكذلك استطالة السلاميات والسيقان وتكوين الجذور .
اما السايتوكاينيات ايضا لها دور مهم في انقسام الخلايا بالاضافة الى الكثير من العمليات الفيسيولوجية الاخرى مثل شيخوخة الورقةleaf senility وانتقال المغذيات nutrients transition والسيادة القمية Apical dominance وتستخدم بتراكيز تتراوح بين (0.01-10) ملغم\لتر، ومن السايتوكاينيات الطبيعية هو الزياتين(Zeatin) .
س\ ماهي اهم انواع السايتوكاينينات ؟
وهناك مكونات اخرى للوسط الغذائي :
• الاكار Agar : مادة هيدروكربونية وهو عبارة عن مسحوق يحصل عليه من الطحالب البحرية ويضاف بمقدار 2-7 غم \لتر واهم انواع الاكار هو ال Defco agar ويستخدم في الزراع النسيجية لاسباب ، ماهي ؟
• وهناك مركبات اخرى مثل حليب جوز الهند (Coconut milk) الذي يساعد على النمو والتمييز للاجزاء النباتية عند زراعتها في الاوساط الغذائية ، يستخدم ايضا الفحم الفعال Activs charcool) حيث انه يعتبر عامل منشط ومثبط وله دور في تحفيز النمو والتمييز العضوي (Organogenesis) والتمييز الجنيني (Embryogenesis) في العديد من النباتات مثل النخيل (Date palm).
س\ ماهي وظائف الفحم الفعال ؟
اما تحضير الوسط الغذائي فيتم كالاتي :
يعد الوسط الغذائي( MS) Murashige &Skoog 1962 من اكثر الاوساط الغذائية استخداما في مجال الزراعة النسيجية ولمعظم النباتات لذا سوف ندرس تحضير هذا الوسط ، ويتكون من اربع محاليل اصل Stock solutions بالاضافة الى عدد من المركبات الاخرى والجدول التالي يبين مكونات كل محلول من هذه المحاليل الاصل :
تذوب كميات الاملاح والفيتامينات الذكورة اعلاه كل على حدة وبصورة تدريجية ثم تنقل الى دورق معياري حجمه 1000 مل ويكمل الحجم الى العلامة بالماء المقطر مرتين ويتم التحضير كالاتي :
1- نضع 400 مل من الماء المقطر مرتين في دورق حجمه 1000 مل .
2- نضيف 100مل من المحلول الاصل رقم 1.
3- نضيف 1مل من المحلول الاصل رقم 2.
4- نضيف 10مل من المحلول الاصل رقم 3.
5- نضيف 1مل من المحلول الاصل رقم .
6- السكروز بمقدار30 غم \لتر
7- تضاف منظمات النمو من الاوكسينات والسايتوكاينينات حسب طبيعة التجربة.
8- بعدها تخلط جيدا لحين الاذابة ثم يكمل الحجم الى 800مل من الماء المقطر مرتين.
9- تعديل درجة حموضة الوسط Ph للوسط 5.7 ±0.1 باستعمال محلول 1 عياري من حامض Hcl او محلول 1 عياري من القاعدة NaoH .
10- نضيف مادة الاكار بمقدار 7غم\لتر ثم يكمل الحجم النهائي الى اللترباستعمال الماء المقطر مرتين، ثم يوضع الوسط على جهاز الخلط المغناطيسي لاذابة الاكار ةتجانس الوسط الغذائي .
11-يصب الوسط الغذائي مباشرة في انابيب الزراعة سعة (24 ×150)ملم بواقع 10مل لكل انبوب وتغلق الفوهة بسدادة قطنية من الداخل وتغلق من الخارج بورق الالومنيوم فويل.
12-نقل اوعية الزراعة الى جهاز التعقيم Autoclave بالبخار وعلى درجة حرارة 121مْ وضغط 1.04كغم\سم2 ولمدة 15دقيقة .
13-تستخرج الانابيب من المعقام وتترك لتبرد في درجة حرارة الغرفة لحين الاستعمال.
عند تحضير الوسط الغذائي يجب ملاحظة بعض الامور المهمة :
•• الماء : Water
يعتبر من اهم مكونات الوسط الغذائي حيث يشكل حوالي 95% وينصح ان يكون الماء مقطرا وان يكون من النوع الثنائي التقطير Double distilled water .
•• درجة الحموضة Ph :
ان درجة حموضة الوسط مهمة جدا لجعل الوسط مناسبا لنمو الجزء او عدم نموه درجة الحموضة 5.7±0.1 مناسبة لنمو النبات داخل الوسط الا ان درجات الحموضة الاقل من 4.5 والاعلى من 7 تؤدي الى ايقاف النمو.
س\ لماذا انخفاض درجة حموضة الوسط نؤدي الى ايقاف النمو؟
تعقيم الوسط الغذائي Sterilization of nutrient medium
كما بينا سابقا بأن اهم المشاكل التي تواجه تقنية الزراعة النسيجية هو التلوث (Contamination) ، وهناك مصادر عديدة للتلوث منها العاملون في المختبر او المواد المستخدمة او التهوية الغير جيدة وكذلك الوسط الغذائي ، حيث انه يجب ان يعقم الوسط الغذائي بصورة جيدة لضمان التخلص من التلوث ويتم تعقيم الوسط باستخدام الاوتوكليف (Autoclave) على درجة حرارة 121 مْ وضغط 1.04كغم\سم2 ولمدة 15دقيقة .
